Analysing ambiguities in trypanosomatids taxonomy by barcoding

BACKGROUND Biodiversity screens and phylogenetic studies are dependent on reliable DNA sequences in public databases. Biological collections possess vouchered specimens with a traceable history. Therefore, DNA sequencing of samples available at institutional collections can greatly contribute to taxonomy, and studies on evolution and biodiversity. METHODS We sequenced part of the glycosomal glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (gGAPDH) and the SSU rRNA (V7/V8) genes from 102 trypanosomatid cultures, which are available on request at www.colprot.fiocruz.br. OBJECTIVE The main objective of this work was to use phylogenetic inferences, using the obtained DNA sequences and those from representatives of all Trypanosomatidae genera, to generate phylogenetic trees that can simplify new isolates screenings. FINDINGS A DNA sequence is provided for the first time for several isolates, the phylogenetic analysis allowed the classification or reclassification of several specimens, identification of candidates for new genera and species, as well as the taxonomic validation of several deposits. MAIN CONCLUSIONS This survey aimed at presenting a list of validated species and their associated DNA sequences combined with a short historical overview of each isolate, which can support taxonomic and biodiversity research and promote culture collections.

Aplicação de planejamento baseado na estrutura do receptor na busca de inibidores de cisteíno-proteases parasitárias (cruzaína (T. cruzi) e PCB (Leishmanioses) / Structure-based virtual screening in the search of parasitic cysteine-proteases inhibitors

Doenças causadas por agentes infecciosos e parasitários são chamadas negligenciadas por não despertarem interesse das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Essas doenças são responsáveis por levar milhões de pessoas à morte todos os anos e afetam principalmente os países pobres e em desenvolvimento. Dentre estas, a doença de Chagas e as leishmanioses, parasitoses causadas por parasitas flagelados pertencentes à família Trypanosomatidae, T. cruzi e Leishmaina sp., respectivamente, se apresentam como um sério problema de saúde pública mundial. Endêmicas em vários países e causando milhões de mortes anualmente, ainda hoje não existem fármacos eficientes e seguros para o tratamento dessas doenças. Este panorama torna eminente a necessidade de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para essas parasitoses. A busca por agentes quimioterápicos envolve a seleção de vias metabólicas essenciais à sobrevivência dos parasitas. Dentre estas, destacamse cisteíno-proteases presentes nesses tripanossomatídeos, deste modo a cruzaína no T. cruzi, e a CPB2.8 na Leishmania mexicana, se mostram como alvos bioquímicos promissores. A disponibilidade de estruturas cristalográficas da cruzaína e do sequenciamento genômico da CPB2.8, nos permite utilizar estratégias de planejamento de fármacos baseado no receptor (SBDD) na identificação de candidatos a fármacos para essas doenças. Entre as técnicas modernas de SBDD utilizadas, a triagem virtual possibilita identificar promissores candidatos a novos fármacos. Assim neste trabalho, obteve-se por meio da técnica de modelagem comparativa o modelo da enzima CPB2.8 de L. mexicana, visto a indisponibilidade da estrutura cristalográfica no Protein Data Bank (PDB). De modo a refinar o modelo construído realizou-se a simulação por dinâmica molecular de 100ns, apresentando estabilização a partir de 80ns. A simulação por dinâmica molecular foi validada por meio do gráfico de Ramachandran, gráfico de raio de giro, RMSD, gráfico de superfície hidrofóbica. Foram calculados os mapas de interação molecular no programa GRID das seguintes proteínas: cruzaína, CPB2.8, catepsina B e catepsina L, e, posteriormente, foi construído um modelo farmacofórico baseado no sítio ativo das enzimas cruzaína e CPB2.8. O modelo farmacofórico da cruzaína foi validado por curva ROC apresentando valor de AUC 61%. A triagem virtual foi realizada para ambas as proteínas e foram obtidos 369 compostos para a cuzaína e 225 compostos para a CPB2.8. Foi realizado o ancoramento molecular desses compostos obtidos pela triagem virtual a fim de diminuir a quantidade de compostos a serem avaliados experimentalmente

Neglected diseases are caused by parasites and infectious agents and affect mainly people in poor areas being prevalent in 149 countries and causing 534,000 deaths per year. Among neglected diseases we can highlight Chagas Disease and Leishmaniasis, both have a high rate of morbidity and mortality and both are addressed in this project in the search of new drugs against a NTD. Nowadays, the search for new drugs involves the selection of biological pathways essential for parasite survival, in this class of parasites we can suggest the cysteine proteases, a proteases family present in Trypanosoma cruzi and and Leishmania ssp. In order to obtain a new agent against Neglected Disease in this work was obtained the model of the enzyme CPB2.8 of L. mexicana using the comparative modeling technique, due to the unavailability of the crystallographic structure in the Protein Data Bank (PDB). In order to refine the constructed model was performed the molecular dynamics simulation of 100ns, stabilization was achieved from 80ns. Molecular dynamics simulation was validated using the Ramachandran graph, radius of rotation graph, RMSD, hydrophobic surface area graph. The molecular interaction fields were calculated in the GRID program to cruzain, CPB2.8, cathepsin B and cathepsin L. Based on molecular interaction fields generated pharmacophoric models were constructed using information about the active site of the enzymes cruzain and CPB2.8. The pharmacophoric model of cruzain was validated by ROC curve presenting AUC value of 61%. Virtual screening was performed for both proteins and 369 compounds were obtained for cuzain and 225 compounds for CPB2.8. Docking studies of these compounds was performed in order to decrease the amount of compounds to be evaluated experimentally

Comparação dos transcritos gênicos sob tensão físico-química entre Trypanosoma cruzi CL-Brener e um tripanossomatídeo monozênico / Comparison of gene transcripts under stress of physical chemistry Trypanosoma cruzi CL-Brener and a trypanosomatid monozênico

Os membros da família Trypanosomatidae são parasitos flagelados que podem infectar vertebrados e ou invertebrados, e de acordo com o tipo e numero de hospedeiros são classificados como parasitas monoxênicos ou heteroxênicos. Neste trabalho realizamos a comparação da detecção de transcritos entre Trypanosoma cruzi clone CL-Brener, espécie heterocênica, e Blastocrithidia culicis, como representante dos tripanossomatídeos monoxênicos, ambos submetidos a tensões físicas, químicas e nutricionais. A questão proposta é se duas espécies de tripanossomatideos com estilos de vida distintos respondem à mesma pressão ambiental (tensão em meio de cultivo) com os mesmos genes. Para tanto foi realizado o crescimento de ambas as espécies em diferentes condições de tensão, como alterações de temperatura, variações de Ph, redução de nutrientes do meio, adição de agentes químicos ao meio, entre outros. O perfil dos transcritos, obtidos, através de RT-PCR com iniciados arbitrário selecionado (RNA fingerprinting), foi comparado entre a condição padrão de crescimento (controle) e as condições alteradas entre as duas espécies. Com isso, foram observados comportamentos distintos dos tripanossomatídeos nas condições físicas impostas, como os extremos de temperaturas. Com esta abordagem metodológica que deve apontar os genes que mais respondem as condições de estresse nas células, obtivemos uma representação do momento transcricional dos protozoários. Foram gerados 772 ESTs após o sequênciamento de fragmentos transcritos de T. cruzi e B. culicis sob tensão, além de ESTs da condição padrão (controle) de B. culicis. Foi observada alta transição de genes de proteínas de superfície (mucinas, trans-sialidades, gp63, etc) sob tensão tanto em T. cruzi como B. culicis, além de proteínas regulatórias da expressão gênica em menos quantidade. Ambas as espécies apresentaram trans splicing de duas formas diferentes, através da utilização de sítios adicionais (AG), antes da ORF, ou splicing alternativo ao gerar transcritos internos às ORFs, concluímos com isso que tripanossomatídeos de espécies e estilos de vida distintos compartilham apenas poucos genes quando em condições de estresse. Grande parte dos transcritos mostraram-se específicos para cada espécie.

Análise do espaçador intergênico do gene de calmodulina em parasitas da família trypanosomatidae: potencial como marcador molecular / Intergenic spacer analysis of calmodulin gene in the family Trypanosomatidae parasites: potential as a molecular marker

Caracterização e descrição de espécie na família Trypanosomatidae ainda depende da morfologia e identidade de hospedeiros dos tripanossomatídeos. Embora vários marcadores moleculaes tenham sido descritos nas ultimas décadas nenhum deles tem sido proposto como uma ferramenta molecular definitiva para complementar a informação ministrada pelas analises morfológicas. Com objetivo de avaliar o potencial do espaçador intergenico do gene de calmodulina como marcador molecular e estudar a composição desta região nos tripanossomatídeos, foram amplificados clonados e seqüenciados os espaçadores intergênicos de Crithidia fasciculata, C. deanei, C. guilhermei, C. acanthocephali, C. luciliae, C. desouzai, Trypanosoma rangeli e comparados com as seqüências que estão publicamente disponíveis de T. brucei, T. cruzi, Leishmania mexicana, L. major, L. infantum, L. arentolae e Phytomonas serpens. Características como organização genética do gene de calmodulina, conteúdo de G+C e presença de repeto~ções de simples seqüência também foram avaliados. O gene de calmodulina mostrou estar organizado in tandem de duas a quatro copias separados por espaçadores intergenicos os quais podem apresentar variação no tamanho. Estes espaçadores mostraram pouca variação intraespecífica no seu conteúdo de G+C sem importar qualquer diferença de tamanho. Nos tripanossomatídeos monoxênicos a tendência aponta que os organismos com um espaçador intergênico maior apresentam um conteúdo maior de G+C. evidenciou-se que a presença de repetições de seqüência simples nos espaçadores, elementos vinculados com a regulação da expressão genética dos tripanossomatideos. Embora o espaçador de calmoduline mostre variabilidade entre as copias do gene, nos demonstramos que seqüências na região 5UTR localizadas imediatamente antes do códon de inicio são espécie-específicas. Uma vez que este segmento genético é de fácil amplificação e esta limitado por uma seqüência conservada (ORF), resulta factível desenvolver uma ferramenta molecular que auxilie a morfologia tradicional na identificação de espécies na família Trypanosomatidae.

Cl gene cluster encoding several small nucleolar RNAs: a comparison amongst trypanosomatids

Small nucleolar RNAs (snoRNAs) are small non-coding RNAs that modify RNA molecules such as rRNA and snRNA by guiding 2'-O-ribose methylation (C/D box snoRNA family) and pseudouridylation reactions (H/ACA snoRNA family). H/ACA snoRNAs are also involved in trans-splicing in trypanosomatids. The aims of this work were to characterise the Cl gene cluster that encodes several snoRNAs in Trypanosoma rangeli and compare it with clusters from Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania major, Leishmania infantum, Leishmania braziliensis and Leptomonas collosoma. The T. rangeli Cl gene cluster is an 801 base pair (bp) repeat sequence that encodes three C/D (Cl1, Cl2 and Cl4) and three H/ACA (Cl3, Cl5 and Cl6) snoRNAs. In contrast to T. brucei, the Cl3 and Cl5 homologues have not been annotated in the Leishmania or T. cruzi genome projects (http//:www.genedb.org). Of note, snoRNA transcribed regions have a high degree of sequence identity among all species and share gene synteny. Collectively, these findings suggest that the Cl cluster could constitute an interesting target for therapeutic (gene silencing) or diagnostic intervention strategies (PCR-derived tools).

Detecção e caracterização de elementos genéticos móveis em tripanosomatídeos usando perfis HMM (Hidden Markov Models) / Detection and characterization of mobile genetic elements in trypanosomatids using profiles HMM (Hidden Markov Models)

Elementos Genéticos Móveis(EGM)são segmentos de DNA que codificam enzimas e outras proteínas que mediam a movimentação do DNA dentro de genomas(mobilidade intracelular)ou entre células bacterianas(mobilidade intercelular).EGM estão presentes na maioria dos genomas, e poderiam ser participantes ancestrais na formação do genoma.A detecção de EGM foi feita usando os perfis Hidden Markov Models(HMM):HMMER e SAM,que foram adaptados para detectar padrões conservados em múltiplas seqüências biológicas,e têm muitas aplicações na procura ou detecção,em bases de dados,de genes de proteínas homólogas.O objetivo deste trabalho foi padronizar o uso dos perfis HMM para a detecção de EGM e desenvolver um sistema baseado na Web para o estudo de genômica comparativa de EGM.HMMER e SAM têm gerado bons resultados e apresentam melhor desempenho que os métodos tradicionais,como o BLAST e FASTA,para a identificação de homologia de seqüências protéicas.Foi testado e padronizado o uso de...Logo depois todas as proteínas agrupadas foram divididas em sub-grupos usando o programa CLUSTALW.Foram obtidos 1734 sub-grupos de um total de 5423 proteínas.Cada sub-grupo foi alinhado usando os programas ALIGN-M,CLUSTALW,LOBSTER,MUSCLE, PROBCONS e T-COFFEE.Perfis HMM foram construídos para cada alinhamento usando HMMER e SAM,para comparar e identificar o melhor HMM,em termos de sensibilidade e especificidade.As curvas ROC foram usadas para este propósito.PROBCONS com HMMER e SAM mostrou melhores resultados que outros programas para a identificação de homólogos distantes.HMMER foi usado para explorar e detectar enzimas de EGM.Em Wolbachia sp.foram detectados 35 genes prováveis e hipotéticos,97 genes reconhecidos como EGM mas anotados como outros genes,e 55 genes de EGM anotados corretamente.Em tripanosomatídeos foram encontrados 107 enzimas de EGM:68 transcriptases reversas,34 ribonucleases H,3 transposases e 2 proteínas gag.A distribuição destas enzimas nos tripanosomatídeos foi:33 em T.vivax,52...

An improved silver staining procedure for schizodeme analysis in polyacrylamide gradient gels

A simple protocol is described for the silver staining of polyacrylamide gradient gels used for the separation of restriction fragments of kinetoplast DNA [schizodeme analysis of trypanosomatids (Morel et al., 1980)]. The method overcomes the problems of non-uniform staining and strong background color which are frequently encountered when conventional protocols for silver staining of linear gels. The method described has proven to be of general applicability for DNA, RNA and protein separations in gradient gels